www.Cancer.ic.ck.ua
Лучший гуманитарный проект

по итогам 4-го Международного форума "HI-TECH 2003"

(подробнее).

Поиск по сайту. Домой.Карта сайта.E-mail

Рак...Жизнь продолжается!

 

Просто и доходчиво о том,
что действительно нужно знать:
 

  Вступление. Цели и задачи сайта.

  Общие сведения об онкологических заболеваниях.

  Причины возникновения и способы профилактики.

  Проявления, диагностика и лечение разных форм рака.

  Новые, перспективные методы диагностики и лечения.

  "Вы скажите где больница. Я туда пойду лечиться..."

  Уход за больными онкозаболеваниями.

  Как сделать жизнь больного раком полноценной.

  Письма больных, их родственников и знакомых.

  Рекомендуемые ресурсы интернет по онкологии.

  Новости сайта. Последние опубликованные статьи.

  Подробнее о нас и наших услугах.

  Структура сайта.

 

Наши партнеры:

Инфоком, Черкассы

Украинский медицинский каталог.

 

Статья раздела  Сменить язык просмотра на УКРАИНСКИЙ  

"Новые, перспективные методы диагностики и лечения"

Молекулярные технологии в диагностике злокачественных новообразований

Д.Ф. Глузман, зав. отделом иммуноцитохимии Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины (ИЭПОР), д-р мед. наук, проф.

С.П. Осинский, зав. отделом модификации противоопухолевой терапии ИЭПОР, д-р мед. наук, проф.

 Статья для журнала "DOCTOR" №4 2003г.

Соднржание статьи:

 

- Вступление

- Маркеры опухолевого роста и их выявление.

- Основы ранней молекулярной диагностики злокачественных опухолей.

- Выявление опухолевых клеток в костном мозге.

- Выявление опухолевых клеток в периферической крови.

- Выявление опухолевых клеток в лимфатических узлах.

 

Достижения молекулярной онкологии позволяют рассматривать онкологическое заболевание как болезнь, которая характеризуется клональной эволюцией трансформированных клеток в том или ином органе или ткани. Известно, что раковые клетки возникают вследствие накопления мутаций в критических протоонкогенах и ассоциированных с опухолями генах-супрессорах. На основании этого логично предположить, что раннее выявление опухолевого зачатка возможно, хотя и сложно методически. Обнаружить опухоль на ранних стадиях ее развития можно при исследовании крови, мочи, ряда биологических жидкостей, в которых могут быть обнаружены те или иные биомолекулы, являющиеся продуктами жизнедеятельности развивающейся опухоли или результатом реакции различных систем организма на появившиеся опухолевые клетки.

 

Есть и другой аспект проблемы, который связан с ранним распознаванием метастазов. Наличие минимальной остаточной опухоли и микрометастазов существенно ограничивает перспективу дальнейшего увеличения показателей выживаемости. До последнего времени поиск микрометастазов осуществляли только традиционными методами световой микроскопии, которые в большинстве случаев оказываются неэффективными. Развитие иммуноцитохимических и молекулярно-биологических технологий сделало возможной идентификацию единичных изолированных опухолевых клеток в лимфатических узлах, серозных жидкостях организма, периферической крови и костном мозге. В частности, удается выявить одну опухолевую клетку среди 1000000 разнообразных по своей природе кроветворных клеток костного мозга. Современная диагностика опухолей предусматривает обязательное применение наряду с классическими морфологическими методами иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов.

 

Маркеры опухолевого роста и их выявление.

 

Существует три группы маркеров опухолевого роста, которые ассоциированы с белками, РНК и ДНК. Белок-ассоциированные маркеры могут определяться в обычных пробах крови рутинными биохимическими и иммунохимическими методами. Среди таких маркеров следует упомянуть простатоспецифический антиген (ПСА) при раке предстательной железы, СА 125 при раке яичника, раково-эмбриональный антиген (РЭА) при карциномах органов пищеварительного тракта, человеческий хорионический гонадотропин при трофобластических опухолях, альфа-фетопротеин при гепатоцеллюлярном раке и эмбриональных карциномах. Выявление этих белков важно для определения прогноза и мониторинга заболевания, раннего обнаружения метастазов и рецидивов опухоли. Однако их применение ограничено, так как они недостаточно специфичны для какой-либо одной опухоли или типа опухолей, а их присутствие в крови часто указывает на уже распространенный процесс. Использование маркеров, ассоциированных с РНК, основано на наличии мутаций в протоонкогенах и генах-супрессорах опухолей, которые могут определяться и в транскриптах. РНК - менее подходящий субстрат для клинической диагностики опухолей, чем ДНК, так как она легко деградирует, но оценка экспрессии на уровне РНК все же осуществима. Современные методы позволяют определять экспрессию тех или иных мутантных генов, в частности путем выделения их РНК-продуктов из клинического материала с последующей обратной транскрипцией (ОТ) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) для амплификации ДНК (ОТ-ПЦР). Этот метод дает возможность определять экспрессию генов в клетках крови, лимфатических узлов и костного мозга. Анализ цельной крови и костного мозга на наличие анормальных транскриптов, полученных из трансформированных клеток, применяют для мониторинга больных с хроническим миелолейкозом, минимальной резидуальной болезнью. Наиболее перспективно использование этого метода для обнаружения микрометастазов - единичных опухолевых клеток в тканях.

 

ДНК - идеальный субстрат для молекулярной диагностики, так как она весьма стабильна и может быть быстро амплифицирована с помощью техники ПЦР, что дает возможность обойтись минимальным количеством клеточного материала. Удалось обнаружить мутации гена р53 в ДНК, определяемой в моче больных раком мочевого пузыря, а также мутации онкогена Ras в ДНК обнаруженной в выделениях при колоректальном раке. Мутации обоих генов выявлены в ДНК, содержащейся в мокроте больных раком легкого.

 

Важное место в обнаружении опухолевых клеток занимает анализ последовательностей нуклеотидов микросателлитных повторов ДНК, который позволяет установить как наличие новой аллели гена (что свидетельствует о нестабильности микросателлитной ДНК), так и потерю одной из его аллелей (потерю гетерозиготности). Такие находки указывают на присутствие клеточных клонов, содержащих измененную генетическую информацию, что характерно для опухолевых клеток. "Микросателлитный анализ" применяли при исследовании мочи у больных раком мочевого пузыря и гипернефромой, слюны при опухолях головы и шеи, панкреатического сока при раке поджелудочной железы, изучении пункционных аспиратов при раке молочной железы, мокроты при раке легкого.

 

Несмотря на возможности, связанные с использованием перечисленных маркеров опухолевого роста, пока еще не существует абсолютно надежных методов ранней (досимптомной) диагностики опухолей. В преобладающем большинстве случаев врачам-онкологам приходится иметь дело с уже развившимися опухолями. И основными задачами являются морфологическое подтверждение диагноза, установление гистоструктуры и гистогенеза опухоли, определение степени ее злокачественности, выявление метастатического поражения регионарных и отдаленных лимфатических узлов, других органов, дифференциальная диагностика с иными патологическими процессами. Решая эти вопросы, используют материал, полученный при биопсии опухолей и лимфатических узлов, клетки крови, пунктаты костного мозга, экссудаты из серозных полостей, а также смывы и соскобы, сделанные во время оперативного вмешательства.

 

Основы ранней молекулярной диагностики злокачественных опухолей.

 

Основой диагностики злокачественных опухолей по материалам биопсий является изучение окрашенных обычными методами гистологических и цитологических препаратов. В то же время применение протокольной терапии диктует необходимость уточнять гистогенез опухолей, особенно низкодифференцированных, как можно раньше выявлять регионарные и отдаленные метастазы. Однако на основе исследования с использованием рутинных гистологических методов не всегда удается установить природу новообразования, уровень дифференцировки составляющих его клеток; бывает очень трудно обнаружить раковые клетки в лимфатических узлах и костном мозге, экссудатах из серозных полостей на ранних этапах метастазирования. Эти сложности удается преодолеть с помощью методов молекулярной биологии, иммуногисто- и иммуноцитохимии, которые базируются на достижениях биотехнологии и данных о молекулярных особенностях опухолевых клеток.

 

С этой целью стали применять иммуногистохимические методы с использованием моноклональных антител (МКАТ) к так называемым опухолеассоциированным антигенам. К последним условно можно отнести онкофетальные, тканеспецифические. органоспецифические антигены, белки промежуточных филаментов, ряд антигенов групп крови и гистосовместимости, ферменты, гормоны, белки, кодируемые онкогенами. Для их выявления на поверхностных мембранах и в цитоплазме клеток разработаны высокоспецифические и чувствительные методы иммуноферментного гистохимического анализа (РАР, АРААР, ABC, EnVision, LSAB и др.), которые могут применяться при изучении криостатных и парафиновых срезов, отпечатков, полученных при эксцизионной биопсии опухолей, мазков из тонкоигольных пунктатов лимфатических узлов и костного мозга, клеточных элементов спинномозговой жидкости и экссудатов из серозных полостей.

 

Пока еще нет точных тестов для определения стадии заболевания до операции. Отсутствуют также достоверные и доступные критерии для выявления больных с высоким риском развития метастазов после удаления первичной опухоли. В то же время установление распространенности опухолевого процесса до появления его клинических признаков имеет очень большое значение для правильного выбора тактики лечения. Наиболее часто используемый метод определения в сыворотке крови больных таких белков, как СА 19-9, СА 242, СА 125, СА 50, ПСА, РЭА, альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и ряд других, не удовлетворяет онкологов, так как содержание этих белков может быть повышено и при заболеваниях неопухолевой природы или при нарушении функции печени. Следует также помнить, что эти маркерные белки в основном обнаруживаются при уже развитом опухолевом процессе и не могут быть полезными для выявления раннего метастазирования или оценки его риска.

 

Благодаря достижениям иммуноцито- и иммуногистохимической, а также молекулярно-биологической техник сегодня можно выявлять так называемые микрометастазы (или оккультные метастазы) в лимфатических узлах, смывах из плевральной и брюшной полостей, в крови и костном мозге. Появляющиеся в литературе данные указывают на то, что применение МКАТ к белкам цитоскелета, ряду ткане- и органоспецифических и опухолеассоциированных антигенов позволяет находить опухолевые клетки в лимфоузлах и других биологических объектах с высокой степенью точности. Особый интерес представляют цитокератины - белки, которые являются неотъемлемыми составляющими частями цитоскелета нормальных и злокачественно трансформированных эпителиальных клеток. Применение МКАТ к цитокератинам, которые экспрессируются исключительно опухолями эпителиального происхождения, дает возможность идентифицировать единичные раковые клетки среди окружающих 100000-1000000 неопухолевых клеток лимфатического узла или костного мозга. И поэтому цитокератины можно рассматривать в качестве надежных маркеров клеток эпителиальной природы.

 

Не менее серьезной проблемой, от решения которой во многом зависят выбор правильного лечения больного со злокачественной опухолью и благоприятный исход заболевания, является обнаружение метастазов до их клинических проявлений. Современные диагностические методы, даже с учетом новейших технологий, не позволяют выявлять одиночные, диссеминированные опухолевые клетки. Для обозначения клеток, которые нельзя обнаружить с помощью обычных светооптических методов, в настоящее время довольно широко применяют термин "микрометастазы". Вместе с тем высказываются мнения о нецелесообразности использования этого термина или необходимости его коррекции. Следует обратить внимание на рекомендации отличать единичные раковые клетки от микрометастазов. Авторы считают, что микрометастазы - это образования из опухолевых клеток, наибольший размер которых не превышает 0,2 см. Циркулирующие (диссеминированные) опухолевые клетки, которые не формируют таких образований, предложено называть одиночными опухолевыми клетками, а их скопления - малыми кластерами. Одиночные опухолевые клетки не контактируют со стенками сосудов или лимфатических синусов и не пенетрируют их. При наличии таких клеток отсутствует внесосудистая (внесинусная) реакция элементов стромы. Микрометастазы же образуются тогда, когда происходят имплантация опухолевых клеток в том или ином органе или ткани и их пролиферация, что часто сопровождается соответствующей реакцией стромальных элементов.

 

Выявление опухолевых клеток в костном мозге.

 

Известно, что опухоли эпителиальной природы часто метастазируют в кости скелета. В связи с этим нельзя считать неожиданным обнаружение опухолевых клеток у некоторых больных со злокачественными опухолями в аспиратах костного мозга, полученного, в частности, при пункции грудины или гребешка подвздошной кости. Примечательно, что скрытые (в англоязычной литературе - оккультные) опухолевые клетки нередко выявляют в костном мозге и у пациентов, у которых опухоли практически не дают метастазов в кости скелета, например при колоректальном раке. Эти находки свидетельствуют о том, что в костном мозге быстрее всего можно обнаружить скрытые опухолевые клетки. Хорошее кровоснабжение костного мозга, развитая сеть синусов и мельчайших капилляров, насыщенность разнообразными клеточными элементами, своеобразие микроокружения - оптимальные условия для метастазирования. Примечательно, что микрометастазы в костном мозге чаще обнаруживают при раке молочной железы, чем, например, при колоректальном раке. Это можно объяснить биологическими особенностями роста первичных опухолей и/или свойствами их клеток, способствующими выживанию этих клеток в костном мозге, что согласуется с известной теорией Педжета о "семенах и почве". Следует также учитывать значение факторов микроокружения, которые поддерживают рост клеток рака молочной железы, но не клеток колоректального рака. Эта гипотеза может объяснить, почему клинические признаки метастатического поражения костей скелета у больных колоректальным раком наблюдаются крайне редко, несмотря на присутствие в костном мозге диссеминированных клеток.

 

Нужно отметить также ошибочность мнения о том, что находящиеся в костном мозге клетки первичных опухолей образуют метастазы лишь в костях скелета. Наличие микрометастазов в костном мозге больных раком молочной железы часто сочетается с обнаружением метастазов как в костях скелета, так и в других тканях, а также с развитием местных рецидивов. Высказывается мнение, что опухолевые клетки, обнаруженные в костном мозге, свидетельствуют о метастатическом потенциале первичной опухоли.

 

Метастазы могут быть выявлены в костном мозге больных, у которых не удалось получить доказательств метастазирования с помощью традиционных клинико-диагностических методов. Для диагностики метастазов костный мозг как объект анализа имеет очень важное свойство: среди его клеточных элементов нет эпителиальных клеток. Поэтому обнаружение в костном мозге цитокератинположительных клеток достоверно указывает на то, что эти клетки являются опухолевыми и, естественно, метастатическими. Наиболее часто метастазы в костный мозг наблюдаются при раке молочной железы, предстательной железы и легкого. В то же время опухолевые клетки с помощью иммуноцитохимических методов с применением МКАТ и ПЦР-анализа были обнаружены также в костном мозге у пациентов с раком желудка, поджелудочной железы, колоректальным раком, раком пищевода, злокачественной меланомой, раком шейки матки, почки, немелкоклеточным раком легкого, раком яичника, щитовидной железы, нейробластомой, гипернефромой, с опухолями головы и шеи, и даже с опухолями головного мозга.

 

В 2000 году появилось сообщение немецких онкологов, которое было названо поворотным пунктом в проблеме контроля эффективности лечения и прогноза заболевания. Известно, что у больных раком молочной железы размер первичной опухоли и результаты исследования лимфатических узлов на наличие в них метастазов являются определяющими для выбора методов лечения и оценки прогноза течения заболевания. В то же время у 20-30 % больных, у которых опухолевые клетки в лимфатических узлах обнаружены не были, в течение 10 лет возникали рецидивы заболевания, тогда как у 40 % пациентов, в лимфатических узлах которых были найдены опухолевые клетки, рецидивов не было. У 36 % из 552 больных раком молочной железы в костном мозге присутствовали опухолевые клетки. Почти 25 % этих больных умерли в течение нескольких лет после оперативного вмешательства. Обобщая результаты ряда исследований, связанных с обнаружением опухолевых клеток в костном мозге и изучением их влияния на течение заболевания, участники 22-го Международного симпозиума по раку молочной железы, проходившего в декабре 1999 года, пришли к заключению, что идентификацию микрометастазов в костном мозге больных с различными формами первичных опухолей можно рассматривать как метод скрининга и мониторинга новой генерации.

 

Имеются различные мнения относительно значения обнаружения раковых клеток в костном мозге: от предположения, что эти клетки (или микрометастазы) -лишь транзиторные опухолевые элементы, попавшие из опухоли в циркуляцию и затем в костный мозг, до допущения, что они отражают метастатический потенциал первичной опухоли. В свое время было высказано предположение, что только 0,01 % опухолевых клеток, которые попадают в кровоток, способны дать начало развитию метастазов. К сожалению, вопрос не получил должного развития, но естественно предположить, что не из всех клеток первичной опухоли, осевших в костном мозге, разовьются очаги метастатического поражения. Во-первых, они должны сохранить жизнеспособность и пролиферативную активность после возможного взаимодействия как с элементами стромы костного мозга, так и с иммунокомпетентными клетками. Во-вторых, им предстоит пройти сложный путь из костного мозга до тех органов и тканей, где они смогут имплантироваться и через целый ряд сложных биологических реакций в ходе межклеточных взаимодействий дать начало росту метастатического узла.

 

Факторы, определяющие продолжительность латентного периода от начала диссеминации опухолевых клеток до клинической манифестации метастазов, неясны. Изучение этих вопросов имеет большое значение для понимания механизмов метастазирования и разработки средств борьбы с ним. Но уже сегодня бесспорна клиническая значимость присутствия опухолевых клеток в костном мозге. Установлено, что большинство осевших в костном мозге опухолевых клеток ко времени хирургического вмешательства не является активно пролиферирующими. По этой причине важным может быть проведение адъювантной терапии, цель которой - воздействовать как на пролиферирующие, так и на непролиферирующие клетки. Диссеминированные опухолевые клетки могут быть атакованы иммунокомпетентными клетками и стать мишенью для адъювантной терапии моноклональными антителами. Одним из средств такой терапии является герцептин, который в настоящее время весьма эффективно применяется при определенных формах рака молочной железы.

 

Выявление опухолевых клеток в периферической крови.

 

Несмотря на определенные успехи хирургической техники и адъювантной системной терапии, показатели выживаемости больных с рядом форм злокачественных опухолей существенно не увеличиваются. Это связывают с ранним развитием метастазов, которые часто не выявляются при установлении первичного диагноза. Причиной неудовлетворительных результатов лечения, несмотря на радикально удаленную опухоль, частично выступает раннее распространение опухолевых клеток в периферической крови.

 

С помощью иммуноцитохимических методов и ПЦР-анализа опухолевые клетки были выявлены в периферической крови больных раком молочной железы (35 %), желудка (17-67 %), шейки матки (25 %), пищевода (41-79%), поджелудочной железы (26-78%), предстательной железы (15%), легкого (27-50 %), колоректальным раком (14-67 %), гепатоцеллюлярной карциномой (33-95 %), назофарингеальным раком (33 %). В преобладающем большинстве случаев поиск опухолевых клеток базировался на выявлении цитокератинов, хотя во многих исследованиях были использованы и другие специфические для той или иной опухоли маркерные белки или mRNA. Сравнительно недавно идентифицирован цитокератин 20-го типа (ЦК-20), экспрессия которого была продемонстрирована как в нормальных эпителиальных клетках слизистой оболочки прямой кишки, так и в клетках опухолей прямой кишки, поджелудочной железы и желудка (рис. 2). У незначительного числа больных раком легкого наблюдалась слабая экспрессия ЦК-20 в опухолевых клетках, тогда как в нормальных клетках легкого она обнаружена не была. В форменных элементах крови (эритроцитах, лейкоцитах, тромбоцитах) ЦК-20 не выявляется, поэтому его экспрессия в крови используется для определения метастазирования у больных раком прямой кишки, желудка, поджелудочной железы. Установлено, что ЦК-20 определяется в периферической крови пациентов как с клинически выявленными метастазами, так и без них.

 

Выявление опухолевых клеток в лимфатических узлах.

 

При злокачественных опухолях многих локализаций, в частности таких как рак молочной железы, прямой кишки, желудка, поджелудочной железы, пищевода, вовлечение в опухолевый процесс региональных лимфатических узлов отрицательно влияет на показатели 5-летней выживаемости. Известно также, что у значительного числа больных, которым были выполнены так называемые радикальные операции, через определенный промежуток времени диагностируются метастазы. Основой их развития становятся необнаруженные опухолевые клетки, присутствовавшие в лимфатических узлах.

 

Дело в том, что при рутинном гистологическом исследовании удаленных во время операции лимфатических узлов опухолевые клетки или их малые агрегаты идентифицировать трудно (к тому же иногда не все лимфатические узлы удаляются во время оперативного вмешательства и подвергаются гистологическому исследованию). И поэтому в настоящее время остро стоит вопрос о необходимости использовать для исследования лимфатических узлов иммуногистохимические и молекулярные методы. С помощью этих методов в лимфатических узлах больных, у которых установлена стадия опухолевого процесса T1-2NO, микрометастазы обнаруживаются: при раке молочной железы в 36 % случаев, раке пищевода - 17-71 %, желудка - 22-36%, поджелудочной железы - 72 %, колоректальном раке - 58 %, немелкоклеточном раке легкого - в 15 % случаев.

 

Для идентификации клеток эпителиальной природы сегодня рекомендуется применять МКАТ не только к цитокератинам, но и к другим специфическим антигенам, экспрессируемым отдельными типами опухолей (к рецепторам эстрогенов и прогестерона при раке молочной железы, тироглобулину и кальцитонину при раке щитовидной железы, альфа-фетопротеину при гепатоцеллюлярном раке и т. д.). Практически доказано, что у трети больных со злокачественными опухолями, у которых при использовании обычных методов метастазы в лимфатических узлах не определяются, с помощью иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов обнаруживаются опухолевые клетки. Это касается и обычных, и так называемых сторожевых (sentinel) лимфатических узлов. В целом же почти у 80 % больных со злокачественными опухолями I и II стадии имеются метастазы в региональных лимфатических узлах, что позволяет поддержать мнение ряда специалистов, что позиция N в системе TNM должна оцениваться с учетом результатов исследования лимфатических узлов с помощью иммуногистохимических и молекулярных методов.

 

Статья из журнала "DOCTOR" №4 2003г.

 

Смотри так же:

Методы диагностики злокачественных опухолей.

Значение ранней диагностики и лечения.

Когда рак только подозревают.

 

Другие наши проекты:

Создание персональных сайтов. Быстро! Дешево! Красиво!

  В начало Раздела.ДомойКарта сайтаE-mailВ начало страницы.

Разработка, наполнение и поддержка врача С. Бондарева,  Украина,  Черкассы
www.sb-studio.com.ua/sb.htm
С предложениями и пожеланиями по оформлению и наполнению обращайтесь:
s-bond@ukr.net 

Aport.ru Украинская баннерная сеть